Den geniale men galne enstöringen Doktor Mabuse vårdas på mentalsjukhus. I världen utanför begås välberäknade avancerade brott, och polisen är förbryllad av brottens nivå. På sjukhuset har Mabuse de andra patienterna i sitt våld, genom hypnotism och briljant manipulation styr han den undre världen trots att han till synes inte har någon kontakt med den.

Doktor Mabuses Testamente bannlystes i Tredje riket och blev Fritz Langs sista film innan han flydde landet, efter att propagandaministern Joseph Goebbels försökt anställa honom.